Wie zuverlässig sind SARS-COV-2-PCR-Assays und die Bestimmung des Ct-Wertes?

Erkenntnisse aus dem österreichischen Ringversuchsprogramm zur Leistungsfähigkeit von SARS-CoV-2-RT-PCR Assays

An dem Ringversuch nahmen 114 Labore teil, die 53 verschiedene RT-PCR- Tests verwendeten. Vier positive Proben mit Ct-Werten zwischen 30.6 und 32.8 wurden analysiert (3 × Delta Variante, 1 × Alpha Variante). Eine gepaarte Probe wurde eingesetzt, um die Reproduzierbarkeit der Ct-Werte zu evaluieren. Zwei negative Proben enthielten einmal genomfreies NaCl und einmal das Betacoronavirus OC43.

Insgesamt zeigte sich eine hohe Leistungsfähigkeit der Assays [2]:

• Hohe Sensitivität: die positiven Proben wurden mit einer Sensitivität von 94-99 % erkannt bei falsch-negativ-Raten von 1%-3%.
• Hohe Spezifität: es traten keine falsch-positiven Befunde auf bei 5% nicht auswertbaren Proben
• Keine Kreuzreaktivität: kein falsch positives Ergebnis bei der Probe mit dem Humanen Coronavirus OC43

Wie präzise ist die Bestimmung des Ct-Wertes innerhalb eines Labors?

Der Ct-Wert korreliert invers mit der Viruslast im Untersuchungsmaterial und erlaubt Rückschlüsse auf die Anzuchtwahrscheinlichkeit des Virus. Er wird zusammen mit weiteren Kriterien herangezogen, um über u.a. über Quarantäne-Maßnahmen zu entscheiden. Gemäß den aktuellen Isolierungs- und Quarantäneregelungen des Landes NRW  ist zur Beendigung der Isolierung auch ein positives Testresultat mit einem Ct- Wert >30 zulässig (siehe hier Neue Isolierungs- und Quarantäneregelungen bei SARS-CoV-2-Infektionen | Arbeit.Gesundheit.Soziales (mags.nrw).

Im österreichischen Ringversuch zeigte sich bei den meisten Assays eine gute Reproduzierbarkeit und hohe Präzision [2]:

• 97 % der Messungen lieferten identische (63%) oder ähnliche Ct-Werte mit einer Differenz von 1 – 3 Zyklen (34%) bei durchschnittlichen Ct-Werten von 32,9 bzw. 33,8
• Höhere gemessene Ct-Werte sind mit einer größeren Streuung der Messergebnisse und einer schlechteren Präzision assoziiert (bei 3% der Messungen wurden Abweichungen von > 3 Zyklen festgestellt bei einem durchschnittlichen Ct-Wert von 36.8)

Ist der ct-Wert zwischen verschiedenen Laboratorien vergleichbar?

Nachdem die SARS-COV-2-PCR-Assays eingeführt wurden zeigte sich jedoch, dass die Ct-Werte bei gleicher Viruslast zwischen verschiedenen Laboratorien und Testprotokollen nur bedingt vergleichbar sind. Auch in dem österreichischen Ringversuch zeigte sich eine Variabilität zwischen verschiedenen Testprotokollen [1]:

• 5% der Messungen zeigten eine Abweichung von 2 oder mehr Zyklen, 7.7. % von über 4 Zyklen

Mittlerweile sind quantitative Referenzproben verfügbar, anhand derer Labore ihre eigene laborinternen Schwellenwerte definieren können [4]. Die Vergleichbarkeit und Bewertung der PCR-Ergebnisse werden somit verbessert. Die aktuellen Kriterien zur Entisolierung von Patienten im stationären Bereich sowie von Bewohnern in  Alten- und Pflegeheimen legen z.B. einen individuellen Schwellenwert zugrunde, der einer Viruslast von 1.000.000 (10^ 6) Kopien/ml entspricht (siehe hier Entisolierung von Patient/-innen im stationären Bereich sowie Bewohner/-innen in Alten- und Pflegeheimen (rki.de)).

Welche Einschränkungen sind bei der Bewertung des Ct-Wertes zu beachten?

Ein hoher ct-Wert bedeutet nicht zwangsläufig, dass der Patient nicht ansteckend ist. Singanayagam et al. konnten noch in 8% der Proben mit einem Ct-Wert >35 replikationsfähiges Virus nachweisen [3]. Das RKI weist ebenfalls darauf hin, dass es sich bei dem Ct-Wert nicht um einen klaren Grenzwert  sondern um einen Orientierungswert handelt, der „im Kontext klinischer und zeitlicher Parameter zu betrachten ist“ (siehe hier Hinweise zur Testung von Patienten auf Infektionen mit dem neuartigen Coronavirus SARS-CoV-2 (rki.de)) Der Wert muss insbesondere mit Rücksicht auf die Präanalytik (Abnahmequalität, Ort der Probenentnahme) und den klinischen Kontext (Krankheitsverlauf und Krankheitsschwere) beurteilt werden.

Literatur

[1] Buchta, C., Görzer, I., et al. (2021) “Variability of cycle threshold values in an external quality assessment scheme for detection of the SARS-CoV-2 virus genome by RT-PCR,” Clinical chemistry and laboratory medicine, 59(5), pp. 987–994. doi: 10.1515/cclm-2020-1602.

[2] Buchta, C. et al. (2022) “A look at the precision, sensitivity and specificity of SARS-CoV-2 RT-PCR assays through a dedicated external quality assessment round,” Clinical chemistry and laboratory

[3] Singanayagam, A. u. a. (2020) „Duration of infectiousness and correlation with RT-PCR cycle threshold values in cases of COVID-19, England, January to May 2020“, Euro surveillance : bulletin Europeen sur les maladies transmissibles [Euro surveillance : European communicable disease bulletin], 25(32). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.32.2001483.

[4] Vierbaum, L. u. a. (2022) „RNA reference materials with defined viral RNA loads of SARS-CoV-2-A useful tool towards a better PCR assay harmonization“, PloS one, 17(1), S. e0262656. doi: 10.1371/journal.pone.0262656.